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Sebbene le basse temperature di congelamento a metà inverno siano un importante parametro limitante nelle regioni temperate ad alta latitudine marginali per la coltivazione del ciliegio, le temperature di congelamento durante l’acclimatazione in autunno, la de-acclimatazione in primavera e la fioritura sono anch’esse fortemente associate alla perdita di raccolti di ciliegie dolci e acide. I danni da congelamento possono essere causati da diverse situazioni climatiche, come il raffreddamento radiativo, advettivo ed evaporativo, e i danni dipendono dall’intensità, dalla velocità di diminuzione della temperatura e dalla durata dell’evento di congelamento. Il danno effettivo è causato principalmente dalla formazione di ghiaccio intracellulare, mentre la formazione di ghiaccio extracellulare può non causare danni. Un evento di congelamento extracellulare lento produrrà un gradiente di potenziale idrico che farà uscire l’acqua dalle cellule, abbassando così il contenuto di acqua e riducendo il rischio di formazione di ghiaccio intracellulare. Eventi di congelamento improvviso e rapido non lasciano il tempo di abbassare il contenuto di acqua intracellulare e quindi spesso producono danni maggiori alle gemme. Un grave disseccamento durante una lunga esposizione a temperature molto basse può causare la coagulazione delle membrane cellulari e la morte delle cellule, ma la maggior parte dei danni da congelamento è causata dalla formazione di cristalli di ghiaccio che distruggono le membrane cellulari e i componenti intracellulari. I diversi tessuti dei boccioli fiorali possono avere una diversa sensibilità alla formazione di ghiaccio, potenzialmente causata da disconnessioni fisiche tra i tessuti, da differenze nel potenziale idrico dei tessuti o dalla presenza o meno di nucleatori di ghiaccio nei tessuti. Durante la fioritura, tali differenze sembrano molto più ridotte rispetto alla metà dell’inverno, quando le gemme sono ancora in ecodormienza. Le conseguenze a lungo termine della formazione di ghiaccio dipendono dal tipo di tessuto interessato e dal numero di cellule coinvolte. I danni all’ovulo stesso e allo stilo sono di solito dannosi, mentre i danni superficiali locali all’ovario o ai tegumenti possono essere riparati parzialmente, ma provocano uno sviluppo anomalo del frutto.

La nucleazione del ghiaccio normalmente si diffonde rapidamente nei tessuti vicini e la transizione di fase dell’acqua in ghiaccio produce un’esotermia nelle gemme che può essere misurata mediante analisi termica differenziale con termocoppie, termografia a infrarossi o calorimetria a scansione differenziale accoppiata a un video termico a infrarossi. In genere vengono misurate un’esotermia ad alta temperatura e un’esotermia a bassa temperatura. La capacità di superraffreddare l’acqua nei germogli è estremamente importante per evitare la formazione di ghiaccio e i danni, e questa capacità dipende dal contenuto di acqua.

L’imbrunimento ossidativo dei tessuti è un sintomo molto comune di danno a seguito di gravi danni da gelo, e la valutazione topografica dell’estensione e dell’intensità di questo fenomeno nelle gemme è importante come metodo per valutare il danno tissutale. La rottura della membrana provoca anche una perdita di elettroliti dal tessuto, che può essere misurata in test standardizzati per quantificare l’entità del danno, anche se come media del tessuto analizzato. Il danno può essere valutato immediatamente dopo il congelamento, con dissezione dei boccioli floreali per individuare i sintomi. In alternativa, i rami possono essere coltivati a temperature controllate o i boccioli asportati possono essere coltivati su terreno di agar per un periodo che consenta il normale germogliamento e lo sviluppo dei fiori o il deterioramento del tessuto floreale.

I boccioli dei fiori di ciliegio possono essere danneggiati dalle temperature di congelamento dall’autunno a dopo la fioritura e durante lo sviluppo dei primi frutti in primavera. Il ciliegio acido è generalmente considerato leggermente più resistente al gelo rispetto al ciliegio dolce, ma esiste un’ampia sovrapposizione che dipende dalla variazione tra le cultivar e dall’interazione con i climi regionali.

In autunno, i danni si verificano spesso quando un periodo caldo è seguito da un rapido calo delle temperature di congelamento. Per le ciliegie acide dell’emisfero settentrionale, ciò avviene tipicamente a novembre. In generale, in pieno inverno, le ciliegie sono normalmente resistenti a temperature comprese tra -20 e -25°C, ma ciò varia significativamente a seconda della cultivar e del clima regionale.

Nelle ciliegie acide, un danno significativo ai germogli si è verificato a temperature invernali di -12°C.

Le evidenze hanno suggerito quattro fasi di cambiamento della tolleranza al gelo nel ciliegio durante la de-acclimatazione in primavera: (i) durante la dormienza, quando i boccioli dei fiori hanno la capacità di super-raffreddare; (ii) un periodo di transizione in cui i boccioli iniziano a gonfiarsi e il super-raffreddamento viene progressivamente perso: (iii) prima dell’emergenza della punta dei petali; e (iv) dopo l’emergenza dei petali, durante il quale fiori e frutti sono molto sensibili al gelo. I danni da gelo primaverile possono verificarsi anche dopo la fioritura, durante lo sviluppo dei primi frutti.

I primi periodi di caldo che si verificano subito dopo il rilascio dell’endodormienza in inverno o all’inizio della primavera possono portare a una transitoria de-acclimatazione e all’attivazione delle gemme; se seguiti da basse temperature e da un rapido congelamento, le gemme possono essere danneggiate. Le cultivar con un basso CR possono iniziare la de-acclimatazione prima se le temperature sono elevate. Le cultivar con una bassa temperatura di base per la de-acclimatazione e/o una HR breve sono spesso più soggette a danni da gelo.

Durante la fioritura, la resistenza dei germogli è molto limitata e anche un gelo poco intenso (-2°C) può danneggiare alcuni germogli. L’epoca di fioritura ha quindi un forte impatto sul rischio di danni da gelo nelle diverse cultivar. Gli studi più citati e tuttora ampiamente utilizzati sulla resistenza al gelo a bassa temperatura delle gemme di ciliegio dolce e acido indicano che le temperature che possono causare danni al 10% e al 90% delle gemme per ogni stadio di sviluppo.

Nel ciliegio acido, hanno studiato l’inizio e la durata delle diverse fasi fenologiche e la tolleranza al gelo in ciascuno di questi periodi in Lituania. Nelle fasi iniziali prima e durante la meiosi (germoglio rigonfio, verde laterale, punta verde e grappolo stretto), non sono stati riscontrati danni a -8°C. Dopo queste fasi, tuttavia, i test a -4°C hanno rivelato le prime lesioni agli ovari e agli stili durante le fasi di sviluppo del primo bianco, della piena fioritura e del germe del frutto. Alcuni hanno riscontrato quasi il 100% di danni nei fiori completamente aperti a -2,5°C in ‘Érdi Bőtermő’, ‘Érdi Nagygyümölcsu’ e ‘Meteor Korai’.

Recentemente, la ricerca ha utilizzato l’analisi termica differenziale e test di congelamento con dissezione al microscopio delle gemme per aggiornare queste conoscenze e ha dimostrato i cambiamenti nelle temperature letali per uccidere il 10 (LT10), il 50 (LT50) o il 90% (LT90) di una popolazione di gemme da fiore in tre cultivar di ciliegio dolce, durante il periodo che va dall’autunno alla fioritura in primavera. I valori di LT10 per le gemme dormienti erano di circa -20°C, mentre allo stadio di grappolo stretto l’LT10 era di soli -6°C. La de-accelerazione è stata particolarmente rapida a partire dalla fine di febbraio a Washington, negli Stati Uniti, in seguito al rilascio dell’endodormienza. La de-acclimatazione e l’attivazione della crescita dipendono fortemente dalla temperatura e, a temperature basse e costanti, l’ecodormienza viene mantenuta, ritardando così l’ulteriore sviluppo dei germogli. Dalla punta verde alla piena fioritura in marzo, la LT10 era di soli -5-2°C. Per la maggior parte del periodo da novembre a marzo, la differenza tra LT10 e LT90 era di circa 7-10°C, il che suggerisce una differenza abbastanza grande nella resistenza delle singole gemme. Questa differenza è scesa a soli 1-3°C in aprile, in prossimità della fioritura, dimostrando che il rischio di danneggiare un’ampia porzione di germogli è molto più elevato durante le gelate primaverili che in inverno. Risultati simili con ‘Burlat’ e ‘Sunburst’ hanno dimostrato che la differenza di temperatura per il 10% e il 90% di danni era trascurabile durante la fioritura, e riscontrato l’82-100% di fiori danneggiati in cultivar di ciliegio dolce a -2,5°C durante la piena fioritura, mentre quasi nessun danno si è verificato alla stessa temperatura nello stadio a palloncino. La conoscenza dei valori attuali di LT nei boccioli secondo i test può, insieme alle previsioni meteorologiche locali, fornire informazioni sui rischi di danni da gelo da utilizzare per avviare attività di protezione dal gelo nei frutteti.

Controllo molecolare della resistenza al freddo

La resistenza al freddo è la capacità delle piante di adattarsi e resistere alle temperature di congelamento. Le piante legnose resistenti al freddo possono sviluppare una tolleranza al gelo a temperature inferiori a -30°C e possono persino superare temperature estremamente basse fino a -196°C, come dimostrato per la betulla (Betula pubescens). Il principale stress a cui sono sottoposte le cellule durante il congelamento è la forte disidratazione indotta dalla presenza di ghiaccio extracellulare, che porta a danni strutturali alle membrane, alla denaturazione delle proteine e allo stress ossidativo. La resistenza al freddo è innescata da fattori ambientali che di solito precedono i periodi di congelamento, come il fotoperiodo breve e la bassa temperatura di non congelamento, ma anche da fattori endogeni come l’acido abscisico (ABA). Esistono diversi meccanismi di tolleranza associati che coinvolgono processi biofisici, tra cui il surraffreddamento profondo dei tessuti xilematici e l’esistenza di siti preferenziali per la formazione di ghiaccio, oltre alla produzione di metaboliti e proteine specifici e a cambiamenti nella struttura delle membrane. I cambiamenti nella composizione della membrana plasmatica sono una caratteristica chiave dell’acclimatazione al freddo, tra cui un aumento della desaturazione degli acidi grassi nei lipidi di membrana, che mantiene la fluidità funzionale della membrana alle basse temperature. È stato dimostrato che il contenuto di acqua e il potenziale osmotico delle gemme e del fusto diminuiscono in autunno e in risposta a un fotoperiodo breve. Questa disidratazione programmata contribuisce alla resistenza dei tessuti prevenendo la formazione di ghiaccio e riducendo gli effetti della disidratazione cellulare indotta dal gelo. Anche gli zuccheri svolgono un ruolo essenziale nell’acclimatazione al freddo, come dimostra la correlazione osservata tra il contenuto di zuccheri e la tolleranza al gelo nelle piante legnose, associata a vari processi, tra cui la formazione di una soluzione cellulare metastabile e l’osmoregolazione. Studiando il contenuto di zuccheri solubili e di enzimi metabolizzatori di saccarosio nel ciliegio dolce, è confermato che i contenuti di zuccheri solubili, zuccheri riducenti e saccarosio erano più elevati nelle fasi di acclimatazione al freddo rispetto alle fasi di non acclimatazione.

È stato dimostrato che gli ormoni vegetali, in particolare l’ABA e l’etilene, svolgono un ruolo essenziale nella segnalazione dello stress delle piante. I livelli di ABA aumentano nelle piante legnose in condizioni che portano all’acclimatazione al freddo e l’applicazione di ABA esogeno può aumentare la tolleranza al gelo senza esposizione a basse temperature. Oltre al ruolo dimostrato nella regolazione della dormienza, i livelli di etilene aumentano durante l’acclimatazione al freddo e l’etilene agisce come regolatore positivo della tolleranza al gelo delle piante attraverso l’attivazione dell’espressione genica indotta dal freddo e la produzione di proteine antigelo. Diversi studi su piante diverse hanno identificato proteine comuni associate alle basse temperature, come i geni regolati dal freddo (COR) e i fattori C-Repeat-Bind-inducibili dal freddo (CBF)/Dehydration-responsive element-binding1 (DREB1). I geni CBF sono indotti entro 15 minuti dall’esposizione della pianta al freddo, seguiti dall’induzione di geni bersaglio di CBF, il “regolone CBF”, che condividono tutti l’elemento LTRE/DRE/ CRT (low-temperature response element, drought responsive element, o c-repeat) nel loro promotore. La famiglia di proteine CBF sembra essere altamente conservata tra le specie vegetali. Tuttavia, la regolazione dei geni CBF nelle piante legnose sembra essere più complessa rispetto alle specie erbacee, con modalità di espressione specifiche per gene, tessuto ed età. Ad esempio, i geni CBF delle piante legnose sono indotti in varie condizioni, tra cui le basse temperature e il gelo, dopo l’esposizione a giorni brevi e la stagione di crescita, suggerendo che partecipano non solo all’acclimatazione al freddo stagionale, ma anche all’acclimatazione a episodi di gelo periodici durante la stagione di crescita.

Nel ciliegio dolce sono stati identificati almeno tre omologhi di CBF/DREB1 e la conservazione della funzione è stata confermata dalla sovraespressione di uno dei geni CBF/DREB1 del ciliegio dolce in Arabidopsis. In una delle linee di piante transgeniche, il gene target CBF/DREB1 cor15a è stato indotto in assenza di trattamento di stress e la pianta ha mostrato una maggiore tolleranza al congelamento. Anche un ortologo putativo di CBF1 della ciliegia acida ha dimostrato di essere sovra-regolato nelle foglie dopo l’esposizione al freddo, supportando così l’ipotesi che il sistema genico CBF sia ampiamente conservato. Alcuni geni DAM del pesco hanno elementi di risposta CRT/DREB nei loro promotori e un promotore del gene DAM del melo ha un elemento simile a CRT, suggerendo che la resistenza al freddo e le vie della dormienza sono intrecciate. In Arabidopsis, molti geni COR sono caratterizzati dalla presenza di un elemento CRT o DRE nel loro promotore e la loro regolazione aumenta in condizioni di non acclimatazione nelle piante transgeniche che sovraesprimono i geni CBF. Studi hanno dimostrato che l’espressione degli omologhi dell’Arabidopsis COR47 aumenta durante l’acclimatazione al freddo. Tra i geni COR, le Deidrine sono indotte da stress che causano disidratazione cellulare, tra cui le basse temperature e il congelamento, e i risultati ottenuti in un’ampia gamma di specie suggeriscono che le Deidrine operano come proteine protettive. In particolare, le Deidrine sono state caratterizzate nel pesco, indotte da basse temperature o stress idrico. Attualmente le conoscenze sulle Deidrine nel ciliegio sono molto limitate, ma uno studio sembra aver identificato proteine sensibili al freddo nei germogli di ciliegio.

I processi di de-acclimatazione e riacclimatazione rimangono meno conosciuti. La de-acclimatazione è spesso definita come una riduzione dei livelli di resistenza al freddo dovuta a diversi fattori come gli stimoli ambientali (temperature più calde e giornate più lunghe), i cambiamenti fenologici e la riattivazione della crescita. Nelle piante legnose, la de-acclimatazione avviene più rapidamente dell’acclimatazione al freddo. Questo processo, insieme al rinnovamento della crescita, è associato alla reidratazione dei tessuti e delle cellule e all’attivazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli zuccheri. La capacità di de-acclimatazione e riacclimatazione gioca un ruolo significativo nel determinare la resistenza delle piante durante vegetazione dei germogli e la fioritura, quando le piante sono particolarmente vulnerabili al freddo, e può variare notevolmente tra specie e cultivar.